Analisa DNA

BAB  I

PENDAHULUAN

A.          Latar Belakang

KINI dengan analisis dan teknologi deoxyribonucleic acid (DNA), kasus-kasus yang sulit terungkap menjadi lebih mudah terungkap dan terpecahkan. Seperti kita ketahui, DNA adalah bahan dasar yang membangun seluruh ciri genetik seseorang. DNA terdapat pada setiap sel manusia, dan seluruh sel memiliki DNA yang sama satu dengan yang lainnya. Misalnya, DNA yang ada pada sel kulit sama dengan DNA yang terdapat pada sel darah maupun DNA pada sel rambut dan lain sebagainya. Selain itu, DNA bersifat unik yakni setiap DNA seseorang berbeda dengan DNA orang yang lain. Karena sifat inilah DNA bisa dipakai sebagai penanda identitas individu, garis keturunan, dan etnis. DNA terdapat pada darah, sel kulit, otot, sel-sel otak, tulang, gigi, rambut, saliva, jantung, mukosa, urine, dan pada seluruh sel manusia.

Analisis DNA manusia bertujuan untuk mengarakterisasi DNA seseorang untuk mengidentifikasi susunan DNA-nya. Barang bukti DNA dapat diambil dari barang bukti biologis, baik dalam keadaan utuh maupun tidak utuh lagi. Hal ini berbeda dengan analisis sidik jari yang mudah rusak atau hilang dan akurasinya sangat bergantung pada keutuhannya. Tes DNA dapat dilakukan hanya dengan barang bukti DNA yang jumlahnya sedikit. Hal ini karena digunakannya teknik yang disebut Polymerase Chain Reaction (PCR) atau reaksi polimerasi berantai. Analisa DNA banyak digunakan untuk karakterisasi sifat genetik pada level molekuler yang secara langsung mencerminkan sifat genotip (materi genetik) yang dimiliki oleh organisme tertentu. Analisis DNA ini terdiri dari tiga tahap yaitu ekstraksi DNA, PCR, dan    elektroforesis.

B.           Rumusan Masalah

1.              Apa itu DNA ?

2.              Bagaimana proses dalam analisa DNA ?

C.          Tujuan Penulisan

1.              Untuk mengetahui apa itu DNA

2.              Mengetahui tahap-tahap dalam proses analisa DNA

3.              Mengetahui manfaat dari analisa DNA

BAB II

PEMBAHASAN

A.          ANALISA DNA

1.      DNA (deoxyribonucleic acid) 

DNA merupakan kependekan dari deoxyribonucleic acid atau dalam Bahasa Indonesia sering juga disebut ADN yang merupakan kependekan dari asam deoksiribonukleat. DNA atau ADN ini merupakan materi genetik yang terdapat dalam tubuh setiap orang yang diwarisi dari orang tua. DNA terdapat  pada inti sel di dalam struktur kromosom dan pada mitokondria.

DNA adalah bahan dasar yang membangun seluruh ciri genetik seseorang. DNA terdapat pada setiap sel manusia, dan seluruh sel memiliki DNA yang sama satu dengan yang lainnya. Misalnya, DNA yang ada pada sel kulit sama dengan DNA yang terdapat pada sel darah maupun DNA pada sel rambut dan lain sebagainya. Selain itu, DNA bersifat unik yakni setiap DNA seseorang berbeda dengan DNA orang yang lain. Karena sifat inilah DNA  bisa dipakai sebagai penanda identitas individu, garis keturunan, dan etnis. DNA terdapat pada darah, sel kulit, otot, sel-sel otak, tulang, gigi, rambut, saliva, jantung, mukosa, urine, dan pada seluruh sel manusia.

Ada tiga struktur DNA yang dikenal selama ini. Struktur-struktur DNA tersebut adalah sebagai berikut:

1.      Struktur primer

DNA tersusun dari monomer-monomer nukleotida. Setiap nukleotida terdiri atas gugusan gula, asam fosfat, dan basa nitrogen.

a.    Gugusan gula (gula pentosa yang dikenal sebagai deokribosa).

b.    Asam fosfat (penghubung dua gugus gula)

c.    Basa nitrogen (adenin dan guanin dari golongan purin serta sitosin dan timin dari golongan pirimidin).

DNA merupakan dua rantai polinukleotida yang saling terpilih membentuk double helix.Dalam rantai DNA tersebut, sitosin ( C ) selalu dihubungkan dengan guanin ( G ) oleh tiga ikatan hidrogen. Adenin ( A ) selalu dihubungkan dengan ( T ) oleh dua ikatan hidrogen.

Perhatikan gambar berikut.

2.      Struktur sekunder

Salah satu sifat biokimia DNA yang menentukan fungsinya sebagai  pembawa informasi genetik adalah komposisi basa penyusun. Pada tahun 1949-1953, Edwin Chargaff menggunakan metode kromatografi untuk  pemisahan dan analisis kuantitatif keempat basa DNA, yang diisolasi dari  berbagai organisme. Kesimpulan yang diambil dari data yang terkumpul adalah sebagai berikut :

a.       Komposisi basa DNA bervariasi antara spesies yang satu dengan spesies yang lain.

b.      Sampel DNA yang diisolasi dari berbagai jaringan pada spesies yang sama mempunyai komposisi basa yang sama.

c.       Komposisi DNA pada suatu spesies tidak berubah oleh perubahan usia, keadaan nutrisi maupun perubahan lingkungan.

d.      Hampir semua DNA yang diteliti mempunyai jumlah residu adenin yang sama dengan jumlah residu timin (A=T), dan jumlah residu guanin yang sama dengan jumlah residu sitosin (G=C) maka A+G = C+T, yang disebut aturan Charrgaff.

e.       DNA yang diekstraksi dari pesies-spesies dengan hubungan kekerabatan yang dekat mempunyai komposisi basa yang hampir sama.

Pada tahun 1953, James D. Watson dan Francis H.C. Crick  berhasil menguraikan struktur sekunder DNA yang berbentuk heliks ganda melalui analisis pola difraksi sinar X dan membangun model strukturnya. Heliks ganda tersebut tersusun dari dua untai polinukleotida

Secara antiparalel (saling berlawanan), berputar ke kanan dan melingkari suatu sumbu. Unit gula fosfat berada di luar molekul DNA dengan basa-basa komplementer yang berpasangan di dalam molekul. Ikatan hidrogen di antara pasangan basa memegangi kedua untai heliks ganda tersebut. Kedua untai melingkar sedemikian rupa sehingga keduanya tidak dapat dipisahkan kembali bila putaran masing-masing untai dibuka.

Dua ikatan glikosidik yang mengikat pasangan basa pada cincin gula, tidak persis berhadapan. Akibatnya, jarak antara unit-unit gula fosfat yang berhadapan sepanjang heliks ganda tidak sama dan membentuk celah antara yang berbeda, yaitu celah mayor dan celah minor.

3.      Struktur tersier

Kebanyakan DNA virus dan DNA mitokondria merupakan molekul lingkar. Konformasi ini terjadi karena kedua untai polinukleotida membentuk struktur tertutup yang tidak berujung. Molekul DNA lingkar tertutup yang diisolasi dari bakteri, virus dan mitokondria seringkali  berbentuk superkoil, selain itu DNA dapat berbentuk molekul linier dengan ujung-ujung rantai yang bebas.

(a)

(b)

 

Gambar 2. Struktur Tersier : (a). Konformasi DNA sirkular

                                               (b). Konformasi DNA linear

B.  TAHAP-TAHAP ANALISIS DNA

DNA adalah suatu molekul primer yang keberadaannya selalu terkait dengan RNA dan protein. Sedangkan dalam menganalisis DNA diperlukan DNA dalam bentuk murni. Untuk memperoleh DNA dalam bentuk murni ini dapat dilakukan cara ekstraksi atau isolasi DNA untuk selanjutnya dilakukan tahapan amplifikasi (PCR) dan analisis DNA melalui Elektroforesis

1.      Ekstraksi atau Isolasi DNA

Dalam ekstraksi atau isolasi DNA jenis sumber sel yang digunakan ada beberapa macam seperti hati, otot, sirip, darah, dan sel hasil kultur. Sedangkan kondisi sumber sel meliputi sumber sel segar, sumber sel terfikasasi dan sumber sel beku.

Prisnsip utama dalam Isolasi DNA ada tiga yakni penghancuran (lisis), ektraksi atau pemisahan DNA dari bahan padat seperti selulosa dan protein, serta pemurnian DNA. Ada beberapa hal yang perlu diperhatikan dalam proses isolasi DNA antara lain harus menghasilkan DNA tanpa adanya kontaminan seperti protein dan RNA, metodenya harus efektif dan bisa dilakukan untuk semua spesies metode yang dilakukan tidak boleh mengubah struktur dan fungsi molekul DNA, dan metodenya harus sederhana dan cepat.

Langkah pertama dalam mengekstraksi DNA adalah proses  perusakan atau penghancuran (lisis) membrane dan dinding sel. Pemecahan sel (lisis) merupakan tahapan dari awal isolasi DNA yang  bertujuan untuk mengeluarkan isi sel. Tahap penghancuran sel atau  jaringan memiliki beberapa cara yakni dengan dengan cara fisik seperti menggerus sampel dengan menggunakan mortar dan pestle dalam nitrogen cair atau dengan menggunakan metode freezing-thawing dan iradiasi. Cara lain yakni dengan menggunakan kimiawi maupun enzimatik. Penghancuran dengan menggunakan kimiawi seperti  penggunaan deterjen yang dapat melarutkan lipid pada membrane sel sehingga terjadi destabilisasi membrane sel. Sementara cara enzimatik seperti menggunakan protainase K seperti untuk melisiskan membrane  pada sel darah serta mendegradasi protein globular maupun rantai  polipeptida dalam komponen sel.

Pada saat diisolasi, inti sel biasanya tersuspensi dalam larutan garam buffer, konsentrasi dan pH dari buffer yang digunakan harus  berada dalam rentang pH 5 sampai 12. Larutan buffer dengan pH rendah akan mengakibatkan depurifikasi dan mengakibatkan DNA terdistribusi ke fase fenol selama proses deproteinisasi. Sedangkan pH larutan yang tinggi di atas 12 akan mengakibatkan pemisahan untai ganda DNA.

Fungsi larutan buffer adalah untuk menjaga struktur DNA selama proses  penghancuran dan purifikasi sehingga memudahkan dalam menghilangkan protein dan RNA serta mencegah aktivitas enzim  pendegradasi DNA dan mencegah perubahan pada molekul DNA. Untuk mengoptimalkan fungsi larutan buffer, dibutuhkan konsentrasi, pH, kekuatan ion, dan deterjen, sehingga dalam proses ini ditambahkan sedikit larutan deterjen pekat seperti SDS (Sodium Doecyl Sulfat ). Deterjen juga bertindak sebagai penghambat semua aktivitas enzim nuklease yang ada selama proses ekstraksi, dimana enzim ini merupakan enzim pendegradasi DNA.

Langkah yang kedua dalam ekstraksi adalah pemisahan DNA dari  bahan-bahan kontaminan seperti RNA dan protein, dimana untuk menghilangkan protein digunakan proteolitik (Proteinase K ) pada larutan DNA dan untuk menghilangkan kontaminan RNA digunakan enzim RNAse ( ribonuklease), serta pengendapan DNA dengan proses sentrifuse, dimana dalam proses sentrifuse asam nukleat diendapkan dengan penambahan etanol dingin, dan pellet yang terbentuk dilarutkan kembali dengan buffer yang mengandung SDW ( Steril Destillation Water) dan pemanenan. Hasil ekstraksi DNA tersebut merupakan tahapan yang penting untuk prosedur berikutnya, sehingga ekstraksi DNA harus dilaksanakan dengan baik dan bebas kontaminansi.

 

2.      PCR (Polymerase Chain Reaction)

PCR merupakan suatu teknik perbanyakan materi genetik salah satunya DNA. Karena kemampuan PCR untuk memperbanyak jumlah materi genetik sangat tinggi, maka PCR dapat digunakan untuk mendeteksi keberadaan materi genetik dengan jumlah sangat rendah dalam suatu spesimen atau sampel. PCR terdiri atas beberapa siklus dimana pada setiap siklus terjadi penggandaan materi genetik dan jika siklus ini dilakukan berulang-ulang, maka materi genetik yang diperoleh akan menjadi banyak sehingga mempermudah deteksi keberadaannya. Secara umum, PCR dilakukan sebanyak 25-35 siklus.

Dalam prosesnya, PCR melibatkan variasi suhu yang mendekati suhu didih air, jadi diperlukan enzim polimerase yang tetap stabil dalam temperatur yang tinggi. Pada proses PCR, enzim polimerase yang digunakan berasal dari bakteri Thermusaquaticus (Taq) yang hidup di lingkungan bersuhu lebih dari 90^oC.

Prinsip analisa PCR adalah reaksi memperbanyak DNA dengan memanfaatkan cara replikasi DNA dengan bantuan enzim DNA  polimerase dan perubahan sifat fisik DNA terhadap suhu. Replikasi DNA terjadi jika DNA utas tunggal yang bertindak sebagai cetakan, dan ada energi pembangun basa yaitu dNTP, maka enzim DNA polimerase akan mengatalisis pembuatan DNA utas lain yang merupakan komplemen utas dari cetakan. Reaksi ini harus dimulai dengan adanya primer atau  pemula. Dalam proses PCR dilakukan sejumlah siklus yang digunakan untuk mengamplifikasi suatu sekuen DNA spesifik. Satu siklus terdiri dari tiga tahapan yaitu :

1). Denaturasi

            Pada tahap ini molekul DNA dipanaskan sampai suhu 94^oC yang menyebabkan terjadinya pemisahan untai ganda DNA menjadi untai DNA tunggal. Untai DNA tunggal inilah yang menjadi cetakan  bagi untai DNA baru yang akan dibuat.

Gambar 3. Untai DNA mengalami denaturasi

2). Penempelan ( Annealing )

Enzim Taq polimerase dapat memulai pembentukan suatu untai DNA baru. Jika ada seuntai DNA berukuran pendek (DNA yang mempunyai panjang sekitar 10 sampai 30 pasang basa) yang menempel pada untai DNA target yang telah terpisah. DNA yang  pendek ini disebut primer. Agar suatu primer dapat menempel dengan tepat pada target, diperlukan suhu yang rendah sekitar 55⁰C selama 30-60 detik.

Untai cetakan

 

Primer Daerah Target Primer Untai cetakan

Gambar 4. Penempelan primer dengan untai DNA yang telah terdenaturasi

3) Pemanjangan (Ektension)

Setelah primer menempel pada untai DNA target, enzim DNA  polimerase akan memanjangkan sekaligus membentuk DNA yang  baru dari gabungan antara primer, DNA cetakan dan nukleotida.

Gambar 4. Perpanjangan DNA secara semi-konservatif

Ketika tiga tahap di atas dilakukan pengulangan, maka untai DNA yang baru dibentuk akan kembali mengalami proses denaturasi,  penempelan dan pemanjangan untai DNA menjadi untai DNA yang baru. Pengulangan proses PCR akan menghasilkan amplifikasi DNA cetakan  baru secara eksponensial.

Komponen-Komponen untuk Reaksi PCR 

 Berikut adalah komponen yang diperlukan untuk reaksi PCR, yaitu:

a.       DNA cetakan / DNA target

Merupakan keseluruhan DNA sampel yang di dalamnya terkandung fragmen DNA target.

b.      Primer

Primer adalah suatu oligonukleotida yang memiliki 10 sampai 40 pb (pb = pasangan basa) dan merupakan komplementer dari DNA target. Pemilihan primer yang tidak sesuai dapat menyebabkan tidak terjadinya reaksi polimerasi antara gen target dengan primer. Berikut adalah kriteria pemilihan primer, yaitu :

1)      Panjang primer : 15-30 pb

2)      Kandungan GC sekitar 50%

3)      Temperatur penempelan kedua primer tidak jauh berbeda

4)      Urutan nukleotida yang sama harus dihindari

5)       Tidak boleh terjadi self dimmer, pair dimmer, atau hairpin

c.       DNA Polimerase

Merupakan enzim yang stabil dalam pemanasan dan umumnya digunakan enzim Taq DNA polimerase ( Taq = Thermus aquaticus). Enzim ini tetap stabil mengamplifikasi DNA walaupun amplifikasi  berjalan pada suhu mendekati titik didih air.

d.       Buffer / Dapar 

Buffer atau dapar yang digunakan umumnya mengandung MgCl₂ yang mempengaruhi stabilitas dan kerja enzim polimerase.

e.        dNTPS

dNTPS atau deoxynukleotide Triphosphates merupakan suatu nukleotida bebas yang berperan dalam perpanjangan primer melalui  pembentukkan pasangan basa dengan nukleotida dari DNA target

3.      Elektroforesis

Elektroforesis adalah teknik yang digunakan untuk memisahkan dan memurnikan suatu makromolekul khusunya DNA berdasarkan perbedaan ukuran. Elektroforesis gel adalah tekhnik memisahkan suatu makromolekul dengan cara memberi gaya pada makromolekul tersebut untuk melewati medium berisi gel dibantu dengan tenaga listrik.

Teknik ini dapat digunakan dengan memanfaatkan muatan listrik yang ada pada makromolekul, misalnya DNA yang bermuatan negatif. Jika molekul yang bermuatan negatif dilewatkan melalui suatu medium, kemudian dialiri arus listrik dari suatu kutub ke kutub yang berlawanan muatannya maka molekul tersebut akan bergerak dari kutub negatif ke kutub positif.

Elektroforesis digunakan untuk menyediakan informasi mengenai ukuran, konfirmasi dan muatan dari DNA.

Elektroforesis gel memisahkan makromolekul berdasarkan laju  perpindahannya melewati suatu gel dibawah pengaruh medan listrik. Elektroforesis gel memisahkan suatu campuran molekul DNA menjadi pita- pita yang masing-masing terdiri atas molekul DNA dengan panjang yang sama. Ada tiga jenis gel yang dapat digunakan dalam elektroforesis DNA, yaitu :

1)      Gel poliakrilamida denaturasi, berfungsi untuk memurnikan penanda oligonukleotida dan menganalisa hasil ekstensi primer.

2)      Gel alkalin agarosa, berfungsi untuk memisahkan rantai DNA yang  berukuran besar.

3)      Gel agarosa formaldehid denaturasi, berfungsi untuk menyediakan system elektroforesis yang digunakan untuk fraksi RNA pada ukuran standart.

Dalam proses elektroforesis terdapat beberapa faktor yang mempengaruhi laju pergerakan dari molekul DNA, yaitu :

1)      Ukuran molekul DNA

Molekul yang berukuran lebih kecil akan cepat bergerak melewati gel karena hambatan yang akan dihadapi tidak lebih banyak dibandingkan molekul berukuran besar

2)      Konsentrasi gel

Semakin tinggi konsentrasi agarosa, semakin kaku gel yang dibuat sehingga sukar untuk dilewati molekul-molekul DNA. Konsentrasi agarosa yang lebih tinggi memudahkan pemidahan DNA yang berukuran kecil, konsentrasi agarosa yang lebih rendah memudahkan pemisahan DNA dengan ukuran yang lebih besar.

3)      Bentuk Molekul

Molekul yang memiliki bentuk elips atau fibril akan lebih cepat bergerak dibandingkan dengan yang berbentuk bulat

4)      Densitas muatan (Muatan per unit volume molekul)

Molekul dengan densitas muatan tinggi akan bergerak lebih cepat dibandingkan molekul dengan densitas muatan yang rendah

5)      Pori-pori gel

Semakin kecil pori-pori gel yang digunaka, semakin lambat pergerakan molekul DNA

6)      Voltase

Semakin tinggi tegangan listrik yang diberikan, semakin cepat pergerakan molekul DNA.

7)      Larutan buffer Elektroforesis

Buffer dengan kadar ion tinggi akan menaikkan konduktansi listrik, sehingga mempercepat migrasi DNA.

Pada proses ini primer yang digunakan adalah primer FBPA ( 5΄GAC AAC GGM TCY GGY 3΄), dan primer RBP 1 (5΄ TAG AAG GTG TGR TGC 3΄). Metode elektroforesis ini dapat dikelompokkan menjadi tiga langkah, yaitu :

1.      Persiapan gel agarosa dengan konsentrasi agarose yang disesuaikan dengan ukuran DNA fragmen yang akan dipisahkan.

2.      DNA sampel dimasukkan ke dalam lubang gel dan gel ditaruh di bak elektroforesis yang dialiri listrik dengan tegangan dan waktu tertentu sehingga menghasilkan pemisahan yang baik.

3.      Gel direndam dalam etidium bromida atau etidium bromida telah digunakan pada gel dan penyngga elektroforesis.

Hasil elektroforesis ini dapat dilihat langsung pada penyinaran dengan sinar UV. Perjalanan DNA ini dipengaruhi oleh arus listrik.

Elektroforesis gel memiliki beberapa komponen yang terdiri dari :

1)      Comb : digunakan untuk membentuk well pada gel agaros

2)      Tray : digunakan sebagai cetakan gel agarosa

3)      Chamber : digunakan sebagai wadah gel agarosa

4)      Sumber listrik : digunakan untuk member arus saat proses elektrofesis

C.  KEGUNAAN ANALISA DNA

Metoda analisis DNA memiliki berbagai kegunaan dalam berbagai  bidang di kehidupan sehari-hari, diantaranya :

1.      Dalam bidang kesehatan

Mendiagnosis penyakit keturunan (penyakit genetik), mendeteksi keberadaan penyebab penyakit infeksi seperti bakteri dan virus, forensik, mengetahui ada atau tidaknya gen-gen penyebab kelainan, dan lain sebagainya.

2.      Dalam bidang Kepolisian

Di bidang kepolisian teknik ini digunakan untuk pemeriksaan DNA, setiap orang memiliki karakteristik khusus, misalnya sidik jari. Sehingga membantu polisi dalam mengungkap sebuah kasus.

BAB  III

PENUTUP

A.    Kesimpulan

DNA merupakan suatu unit terkecil dari makhluk hidup yang merupakan pembawa sifat keturunan. Analisa DNA banyak digunakan untuk karakterisasi sifat genetik pada level molekuler yang secara langsung mencerminkan sifat genotip (materi genetik) yang dimiliki oleh organisme tertentu. Analisis DNA ini terdiri dari tiga tahap yaitu ekstraksi DNA, PCR, dan    elektroforesis. DNA terdiri atas dua utas  benang polinukleotida yang saling berpilin membentuk heliks ganda (double helix). Sekarang ini, profil DNA berhasilmemungkinkan untuk mengaitkan sampel DNA ke orang tertentu dengan tingkat kepastian yang tinggi, memberikan sesuatu yang baru di bidang penegak hokum, ilmu forensic dan anti penuaan.